大肠癌p53基因突变检测的临床意义
作者：郁宝铭 王 灏 郑民华 张浩波 陆爱国 李宏为
单位：上海第二医科大学附属瑞金医院外科(上海200025)
关键词：结肠直肠肿瘤；基因，p53突变；预后
肿瘤990611 中图分类号：R735.34 文章标识码：B 文章编号：1000-7431(1999)06-0353-03
大肠癌为我国常见恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。但其总的治疗效果仍不理想，复发和死亡屡有所见。因此如何提高治疗效果乃当务之急。随着分子生物学理论和技术的发展，对大肠癌基因突变和表达的研究也日益广泛和深入。p53基因突变被认为是腺瘤-腺癌序列演变中的一个重要因素，并具有预后意义。本文通过对大肠癌标本的检测结合病理和临床资料探讨大肠癌p53基因突变的临床意义及其对预后的价值。
, 百拇医药
材料与方法
自1996年3月～1997年3月，作者随机对手术切除的大肠癌69例标本，取癌灶组织和肿瘤远切端正常大肠粘膜组织，置-80℃中保存，用PCR-SSCP法检测p53基因第5～8外显子的突变情况。病变属Dukes′A期2例，B期35例，C期18例和D期14例。大肠癌细胞分化中， Broder Ⅰ级4例，Ⅱ级60例，Ⅲ级2例，Ⅳ级3例；肿瘤大体类型：增生型21例，溃疡型32例，浸润型16例。每例均取直径1 cm大小的癌组织一块，制备匀浆，另取正常人外周血白细胞及正常肠粘膜组织按常规法提取DNA并配制成终末浓度为0.1 μg/μl的应用液-20 ℃保存。
PCR-SSCP检测p53基因第5～8外显子突变情况。PCR扩增：PCR反应体系为50 μl，其余各组分参照文献，p53基因点突变主要发生在外显子5、6、7、8中，四对引物设计参见文献[1～3]，引物序列及反应条件如表1所示。SSCP分析：取10 μl PCR反应产物，加入等体积95%甲酰胺染料(20 mmol/L EDTA，0.1%溴酚兰)，95℃保温7 min后立即置于冰浴中7 min。用8%聚丙烯酰胺凝胶(acrylamide∶bisacrylamide=49∶1)，4℃条件下电泳3 h(缓冲液：0.5×TBE，pH 8.0)，直至溴酚兰接近凝胶底部为止。凝胶用硝酸银染色；在甲醇∶水∶冰乙酸(5∶1∶4)混合液中固定0.5 h，3.4 mmol/L重铬酸钾、3.2 mmol/L硝酸混合液中氧化10 min×2次，蒸馏水中漂洗2 min×4次，12 mmol/L硝酸银中染色30 min，蒸馏水漂洗5 min，在0.28 mol/L碳酸钾，0.03%甲醛中显色至条带清晰，10%乙醇-5%醋酸中定色5～10 min；结果判断：通过与对照样品的条带比较，判断待析样品是否有突变存在，与对照条带有不同者存在突变，完全相同者则无突变(见表1)。
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表1 用于p53基因突变检测的PCR引物及扩增条件 扩增的外显子
扩增片段长度(bp)
引物序列(5′～3′)
扩 增 条 件
5
183
TACTCCCCTGCCCCTCAACAAG
热变性 35×
ATCGCTATCTGAGCAGCGCTC
94℃ 1 min，55℃ 1 min,72℃ 1 min
, 百拇医药 6
114
GGTCTGGCCCCTCCTCAGCAT
热变性 35×
CTCAGGCGGCTCATAGGGCAC
94℃ 1 min，63℃ 1 min,72℃ 1 min
7
111
GTTGGCTCTGACTGTACCACC
热变性 35×
CCTGGAGTCTTCCAGTGTGAT
, 百拇医药
94℃ 1 min，55℃ 1 min,72℃ 1 min
8
135
TGGTAATCTACTGGGACGGAA
热变性 35×
TCGCTTAGTGCTCCCTGGGGG
94℃ 1 min，55℃ 1 min,72℃ 1 min
统计学处理 表2中关于p53基因突变与Dukes′分期关系的统计方法，选用t检验进行统计处理。对于Dukes′D期突变组与未突变组生存期的统计，选用Kaplan-Meier生存分析法进行统计。
表2 病灶组织与正常组织p53基因突变与Dukes′分期的关系
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A
B
C1
C2
D
合计
Ca(+)N(+)
0
8
2
1
2
13
, 百拇医药
Ca(+)N(-)
1
9
6
0
7
23
Ca(-)N(-)
1
18
9
0
5
33
, 百拇医药
总计
2
35
17
1
14
69
注：Ca为病灶组织 N为正常组织 (+)为p53基因突变 (-)为p53基因未突变(P>0.05)结果
69例大肠癌标本中，36例p53基因突变，突变率为52.17%，其中第5外显子突变32例，占88.89%，第5、6外显子双突变1例，第6外显子突变1例，第7和8外显子各突变1例。附图显示部分标本p53基因第5外显子扩增产物SSCP分析结果。36例p53基因突变阳性的病例中，癌组织和远切端正常粘膜均示突变阳性者13例，占36.11%(13/36)。病灶组织与正常组织p53基因突变与Dukes′分期关系见表2，经统计学分析，p53基因突变与Dukes′分期无明显相关性(P>0.05)。由于随访时间较短，本文仅对Dukes′D期的14例患者进行了2～12月的随访，结果发现p53基因未突变的5例中2例死亡，死亡率40%，2例死亡患者生存期均小于5个月，5例患者平均生存期为7.2月。而p53突变的9例中7例死亡(其中2例癌灶组织、正常组织突变者均已死亡，7例癌灶组织突变、正常组织未突变的患者中，5例死亡)，死亡率77.8%，7例死亡患者生存期均小于4个月，9例患者平均生存期为4.8月，Dukes′D期突变组与未突变组，经统计学处理后，生存期有显著差异(P=0.041)。
]
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附图 部分标本p53基因外显子5 PCR-SSCP分析结果
箭头所示为突变引起电泳迁移率改变条带
1 取自健康人外周血白细胞，2 取自正常肠粘膜
3、4 取自大肠癌病灶
讨论
大肠癌的p53基因突变率在50%～80%之间，且主要发生在第5～8外显子上[4，5]。本文从69例大肠癌手术切除标本的p53基因5～8外显子检测中发现总的突变率为52.17%，而88.89%的突变率发生在第5外显子，国外报道亦认为第5外显子突变占大多数[6，7]，表明如重点检测第5外显子，已能基本反映出p53基因有无突变。本文显示绝大多数(88.89%)标本为第5外显子突变，原因可能有2点：1.69例标本中多数为直肠癌患者，而Watatani等报道不同部位的大肠癌标本中，外显子有不同的突变率[8]，2.部分患者术前接受过辅助化疗和放疗，放化疗在一定程度上可导致p53基因突变[9]，但目前尚无放化疗后第5外显子突变率高的报道。关于以上2点作者已开展了有关研究。本组资料还显示p53基因突变与患者性别、肿瘤大体类型、组织学分类、细胞分化、病理分期等均无明显关系，与文献报道基本一致[10]。
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此外，作者对Dukes′D期的14例患者经2～12月随访发现，p53基因未突变患者生存期明显较突变的患者长(7.2月vs 4.8月P=0.041)，而前者死亡率亦低于后者，结果表明p53基因检测对判断Dukes′D期患者预后有一定的参考价值。进一步研究发现，在Dukes′D期p53基因突变的9例中，2例正常粘膜组织亦突变的患者全部死亡，而7例正常粘膜组织未突变者5例死亡，由于例数少，无统计学差异，这是否提示远端正常粘膜组织同癌灶组织均发生p53基因突变者，其预后更差，这一点尚需深入研究。同时由于全部病例均为前瞻性研究，随访时间较短(随访时间不超过1年)，故目前仅对Dukes′D期患者有意义，而p53基因突变与Dukes′A、B、C期患者预后是否与Dukes′D期一致仍待长时间随访。国外已有报道认为，p53基因突变生存期明显短于未突变者，且认为p53基因突变的患者对化疗不敏感，继而影响其预后[11]。
总之，从本组结果看：半数以上大肠癌患者存在p53基因突变，且突变热点位于第5外显子，故提示临床上可将大肠癌p53基因的检测重点放在第5外显子上；同时通过对晚期患者短期随访发现，p53基因突变者生存期明显短于未突变者，提示p53基因突变与预后有一定的相关性，但是否可推广至Dukes′A、B、C期患者尚待进一步论证。
, http://www.100md.com
作者简介：郁宝铭，男，大学本科，教授，博导。
参考文献[1]Hirotoshi H,Masakazu U,Kazuo F, et al. P53 gene mutations in early colorectal carcinoma de novo vs adenoma-carcinoma sequence〔J〕. Int J Cancer,1991,64:47
[2]Kaisa K,Sakari H, Kari S,et al. Rapid and effective detection of mutations in the p53 gene using nonradioactive single-stand conformation polymorphism (SSCP)technique applied on phast system〔J〕.J Virol Methods,1995,51:43
, 百拇医药
[3]Jacqueline AMV,Witjes JA,Marras SAE, et al. Predictive value of p53 mutations analyzed in bladder washings for progression of high-risk superficial bladder cancer〔J〕.Clin Cancer Res,1996,2:1055
[4]Harris CC,Hollstein M.Clinical implications of the p53 tumor suppressor gene〔J〕. N Engl J Med,1993,329:1318
[5]Bosari S,Viale G,Bossi P, et al. Cytoplasmic accumulation of p53 protein:an independent prognostic indicator in colorectal adenocarcinomas〔J〕.Cancer Inst,1994,86:681
, http://www.100md.com
[6]Carder PJ,Cripps KJ,Morris R, et al. Mutations of the p53 gene precedes aneuploid colonal divergence in colorectal carcinoma〔J〕.Br J Surg,1995,71:215
[7]Aoki T,Takeda S,Yanagisawa A, et al. APC and p53 mutations in de novo colorectal adenocarcinoma〔J〕. Hum Mutat,1994,3:342
[8]Watatani M,Yoshida T,Kuroda K, et al. Allelic loss of chromosome 17p,mutation of the p53 gene,and microsatellite instability in right and left side colorectal cancer〔J〕.Cancer,1996,77(8 Suppl):1688
, 百拇医药
[9]Lowe SW,Bodis S,McClatchey A, et al. P53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo〔J〕.Science,1994,216:807
[10]Zeng ZS,Sarkis AS,Zhang ZF, et al. P53 Nuclear overexpression: an independent predictor of survival in lymph-node positive colorectal cancer patients〔J〕. J Clin Oncol,1994,10:2043
[11]Eldiry WS,Tokino T,Veloulecu VE, et al. VAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression〔J〕.Cell,1993,75:817
(收稿日期：1997-12-08 修回日期：1998-08-14), 百拇医药
单位：上海第二医科大学附属瑞金医院外科(上海200025)
关键词：结肠直肠肿瘤；基因，p53突变；预后
肿瘤990611 中图分类号：R735.34 文章标识码：B 文章编号：1000-7431(1999)06-0353-03
大肠癌为我国常见恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。但其总的治疗效果仍不理想，复发和死亡屡有所见。因此如何提高治疗效果乃当务之急。随着分子生物学理论和技术的发展，对大肠癌基因突变和表达的研究也日益广泛和深入。p53基因突变被认为是腺瘤-腺癌序列演变中的一个重要因素，并具有预后意义。本文通过对大肠癌标本的检测结合病理和临床资料探讨大肠癌p53基因突变的临床意义及其对预后的价值。
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材料与方法
自1996年3月～1997年3月，作者随机对手术切除的大肠癌69例标本，取癌灶组织和肿瘤远切端正常大肠粘膜组织，置-80℃中保存，用PCR-SSCP法检测p53基因第5～8外显子的突变情况。病变属Dukes′A期2例，B期35例，C期18例和D期14例。大肠癌细胞分化中， Broder Ⅰ级4例，Ⅱ级60例，Ⅲ级2例，Ⅳ级3例；肿瘤大体类型：增生型21例，溃疡型32例，浸润型16例。每例均取直径1 cm大小的癌组织一块，制备匀浆，另取正常人外周血白细胞及正常肠粘膜组织按常规法提取DNA并配制成终末浓度为0.1 μg/μl的应用液-20 ℃保存。
PCR-SSCP检测p53基因第5～8外显子突变情况。PCR扩增：PCR反应体系为50 μl，其余各组分参照文献，p53基因点突变主要发生在外显子5、6、7、8中，四对引物设计参见文献[1～3]，引物序列及反应条件如表1所示。SSCP分析：取10 μl PCR反应产物，加入等体积95%甲酰胺染料(20 mmol/L EDTA，0.1%溴酚兰)，95℃保温7 min后立即置于冰浴中7 min。用8%聚丙烯酰胺凝胶(acrylamide∶bisacrylamide=49∶1)，4℃条件下电泳3 h(缓冲液：0.5×TBE，pH 8.0)，直至溴酚兰接近凝胶底部为止。凝胶用硝酸银染色；在甲醇∶水∶冰乙酸(5∶1∶4)混合液中固定0.5 h，3.4 mmol/L重铬酸钾、3.2 mmol/L硝酸混合液中氧化10 min×2次，蒸馏水中漂洗2 min×4次，12 mmol/L硝酸银中染色30 min，蒸馏水漂洗5 min，在0.28 mol/L碳酸钾，0.03%甲醛中显色至条带清晰，10%乙醇-5%醋酸中定色5～10 min；结果判断：通过与对照样品的条带比较，判断待析样品是否有突变存在，与对照条带有不同者存在突变，完全相同者则无突变(见表1)。
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表1 用于p53基因突变检测的PCR引物及扩增条件 扩增的外显子
扩增片段长度(bp)
引物序列(5′～3′)
扩 增 条 件
5
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TACTCCCCTGCCCCTCAACAAG
热变性 35×
ATCGCTATCTGAGCAGCGCTC
94℃ 1 min，55℃ 1 min,72℃ 1 min
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GGTCTGGCCCCTCCTCAGCAT
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CTCAGGCGGCTCATAGGGCAC
94℃ 1 min，63℃ 1 min,72℃ 1 min
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GTTGGCTCTGACTGTACCACC
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CCTGGAGTCTTCCAGTGTGAT
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TGGTAATCTACTGGGACGGAA
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TCGCTTAGTGCTCCCTGGGGG
94℃ 1 min，55℃ 1 min,72℃ 1 min
统计学处理 表2中关于p53基因突变与Dukes′分期关系的统计方法，选用t检验进行统计处理。对于Dukes′D期突变组与未突变组生存期的统计，选用Kaplan-Meier生存分析法进行统计。
表2 病灶组织与正常组织p53基因突变与Dukes′分期的关系
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A
B
C1
C2
D
合计
Ca(+)N(+)
0
8
2
1
2
13
, 百拇医药
Ca(+)N(-)
1
9
6
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7
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Ca(-)N(-)
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总计
2
35
17
1
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注：Ca为病灶组织 N为正常组织 (+)为p53基因突变 (-)为p53基因未突变(P>0.05)结果
69例大肠癌标本中，36例p53基因突变，突变率为52.17%，其中第5外显子突变32例，占88.89%，第5、6外显子双突变1例，第6外显子突变1例，第7和8外显子各突变1例。附图显示部分标本p53基因第5外显子扩增产物SSCP分析结果。36例p53基因突变阳性的病例中，癌组织和远切端正常粘膜均示突变阳性者13例，占36.11%(13/36)。病灶组织与正常组织p53基因突变与Dukes′分期关系见表2，经统计学分析，p53基因突变与Dukes′分期无明显相关性(P>0.05)。由于随访时间较短，本文仅对Dukes′D期的14例患者进行了2～12月的随访，结果发现p53基因未突变的5例中2例死亡，死亡率40%，2例死亡患者生存期均小于5个月，5例患者平均生存期为7.2月。而p53突变的9例中7例死亡(其中2例癌灶组织、正常组织突变者均已死亡，7例癌灶组织突变、正常组织未突变的患者中，5例死亡)，死亡率77.8%，7例死亡患者生存期均小于4个月，9例患者平均生存期为4.8月，Dukes′D期突变组与未突变组，经统计学处理后，生存期有显著差异(P=0.041)。
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附图 部分标本p53基因外显子5 PCR-SSCP分析结果
箭头所示为突变引起电泳迁移率改变条带
1 取自健康人外周血白细胞，2 取自正常肠粘膜
3、4 取自大肠癌病灶
讨论
大肠癌的p53基因突变率在50%～80%之间，且主要发生在第5～8外显子上[4，5]。本文从69例大肠癌手术切除标本的p53基因5～8外显子检测中发现总的突变率为52.17%，而88.89%的突变率发生在第5外显子，国外报道亦认为第5外显子突变占大多数[6，7]，表明如重点检测第5外显子，已能基本反映出p53基因有无突变。本文显示绝大多数(88.89%)标本为第5外显子突变，原因可能有2点：1.69例标本中多数为直肠癌患者，而Watatani等报道不同部位的大肠癌标本中，外显子有不同的突变率[8]，2.部分患者术前接受过辅助化疗和放疗，放化疗在一定程度上可导致p53基因突变[9]，但目前尚无放化疗后第5外显子突变率高的报道。关于以上2点作者已开展了有关研究。本组资料还显示p53基因突变与患者性别、肿瘤大体类型、组织学分类、细胞分化、病理分期等均无明显关系，与文献报道基本一致[10]。
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此外，作者对Dukes′D期的14例患者经2～12月随访发现，p53基因未突变患者生存期明显较突变的患者长(7.2月vs 4.8月P=0.041)，而前者死亡率亦低于后者，结果表明p53基因检测对判断Dukes′D期患者预后有一定的参考价值。进一步研究发现，在Dukes′D期p53基因突变的9例中，2例正常粘膜组织亦突变的患者全部死亡，而7例正常粘膜组织未突变者5例死亡，由于例数少，无统计学差异，这是否提示远端正常粘膜组织同癌灶组织均发生p53基因突变者，其预后更差，这一点尚需深入研究。同时由于全部病例均为前瞻性研究，随访时间较短(随访时间不超过1年)，故目前仅对Dukes′D期患者有意义，而p53基因突变与Dukes′A、B、C期患者预后是否与Dukes′D期一致仍待长时间随访。国外已有报道认为，p53基因突变生存期明显短于未突变者，且认为p53基因突变的患者对化疗不敏感，继而影响其预后[11]。
总之，从本组结果看：半数以上大肠癌患者存在p53基因突变，且突变热点位于第5外显子，故提示临床上可将大肠癌p53基因的检测重点放在第5外显子上；同时通过对晚期患者短期随访发现，p53基因突变者生存期明显短于未突变者，提示p53基因突变与预后有一定的相关性，但是否可推广至Dukes′A、B、C期患者尚待进一步论证。
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作者简介：郁宝铭，男，大学本科，教授，博导。
参考文献[1]Hirotoshi H,Masakazu U,Kazuo F, et al. P53 gene mutations in early colorectal carcinoma de novo vs adenoma-carcinoma sequence〔J〕. Int J Cancer,1991,64:47
[2]Kaisa K,Sakari H, Kari S,et al. Rapid and effective detection of mutations in the p53 gene using nonradioactive single-stand conformation polymorphism (SSCP)technique applied on phast system〔J〕.J Virol Methods,1995,51:43
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[3]Jacqueline AMV,Witjes JA,Marras SAE, et al. Predictive value of p53 mutations analyzed in bladder washings for progression of high-risk superficial bladder cancer〔J〕.Clin Cancer Res,1996,2:1055
[4]Harris CC,Hollstein M.Clinical implications of the p53 tumor suppressor gene〔J〕. N Engl J Med,1993,329:1318
[5]Bosari S,Viale G,Bossi P, et al. Cytoplasmic accumulation of p53 protein:an independent prognostic indicator in colorectal adenocarcinomas〔J〕.Cancer Inst,1994,86:681
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[6]Carder PJ,Cripps KJ,Morris R, et al. Mutations of the p53 gene precedes aneuploid colonal divergence in colorectal carcinoma〔J〕.Br J Surg,1995,71:215
[7]Aoki T,Takeda S,Yanagisawa A, et al. APC and p53 mutations in de novo colorectal adenocarcinoma〔J〕. Hum Mutat,1994,3:342
[8]Watatani M,Yoshida T,Kuroda K, et al. Allelic loss of chromosome 17p,mutation of the p53 gene,and microsatellite instability in right and left side colorectal cancer〔J〕.Cancer,1996,77(8 Suppl):1688
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[9]Lowe SW,Bodis S,McClatchey A, et al. P53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo〔J〕.Science,1994,216:807
[10]Zeng ZS,Sarkis AS,Zhang ZF, et al. P53 Nuclear overexpression: an independent predictor of survival in lymph-node positive colorectal cancer patients〔J〕. J Clin Oncol,1994,10:2043
[11]Eldiry WS,Tokino T,Veloulecu VE, et al. VAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression〔J〕.Cell,1993,75:817
(收稿日期：1997-12-08 修回日期：1998-08-14), 百拇医药